细胞入门

细胞传代培养

预计耗时：约 1 小时（不含培养观察）

前置知识 / 技能

无前置要求，可直接开始。

实验目的

将培养的细胞按比例稀释后接种到新培养容器中，维持细胞对数生长期，避免接触抑制与营养耗尽，为后续实验提供状态良好的细胞。

实验原理

贴壁细胞长满培养瓶底约 80–90% 时，用胰蛋白酶（Trypsin）消化细胞间连接及细胞与基质间的黏附蛋白，使细胞脱壁并分散成单细胞悬液；加入含血清培养基终止消化后，按比例稀释接种到新培养瓶，细胞重新贴壁并继续增殖。

实验步骤

1准备
预热培养基、PBS 和胰酶至 37℃，超净工作台紫外消毒并通风。
2观察
倒置显微镜下确认细胞汇合度达 80–90%、形态正常、无污染。
3清洗
弃去旧培养基，用 PBS 轻轻润洗 1–2 次。
4消化
加入适量 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 覆盖瓶底，37℃ 孵育至细胞变圆、脱落。
⚠ 消化时间不宜过长，避免损伤细胞。
5终止消化
加入含血清培养基终止消化，轻轻吹打使细胞分散成单细胞悬液。
6离心
将悬液转移至离心管，低速离心（如 1000 rpm，5 min），弃上清。
7重悬与接种
用新鲜培养基重悬细胞，按比例（如 1:3–1:5）接种到新培养瓶。
8培养
补齐培养基，放入 37℃、5% CO₂ 培养箱，轻轻摇匀后静置培养。

所需试剂

DMEM 高糖培养基
胎牛血清（FBS）（10%）
0.25% 胰蛋白酶-EDTA
PBS 缓冲液（无菌）
青霉素-链霉素双抗（1%）

所需仪器

超净工作台
CO₂ 培养箱
倒置显微镜
台式离心机
水浴锅
微量移液器

安全提示

⚠ 全程无菌操作，防止细菌、真菌和支原体污染。
⚠ 超净台使用前紫外消毒并通风，操作中避免手臂频繁进出。
⚠ 废弃培养基和细胞悬液按生物危害废物处理。
⚠ 胰酶消化时间不宜过长，避免过度消化损伤细胞。

预期结果

细胞在 4–24 小时内重新贴壁，形态正常、折光性好；24 小时后汇合度约 30–50%，进入对数生长期。

结果分析

✅ 正常结果

传代后细胞在 4–24 小时内重新贴壁并铺展，形态与亲代一致（如梭形、上皮样），折光性好、胞质透明，无漂浮死细胞；24 小时后汇合度约 30–50%。

解读：说明消化适度（细胞未受损）、接种密度合适、培养基与培养条件正常，细胞状态健康、增殖旺盛，可用于后续实验。

⚠️ 异常结果

1细胞不贴壁或大量漂浮
原因：胰酶消化过度、消化后未充分中和、细胞本身状态差或已凋亡、培养瓶表面处理不当。
2细胞生长缓慢、汇合度低
原因：接种密度过低、培养基营养不足或血清质量差、培养条件（温度 / CO₂）不当、细胞老化。
3细胞形态改变（变圆、空泡化、脱落）
原因：传代次数过多导致细胞老化、支原体污染、消化不当或培养基 pH 异常。
4培养基浑浊（微生物污染）
原因：无菌操作不当、培养基或耗材污染、抗生素缺失或失效。
5细胞聚团或分布不均
原因：消化不充分、吹打不充分未成单细胞悬液、接种后未摇匀。