生物制药实验流程导航

学习路径

按由易到难的顺序学习实验，或查看实验之间的依赖关系。

入门

  1. 1

    大肠杆菌感受态制备

    分子

    制备能高效摄取外源 DNA 的大肠杆菌感受态细胞，为质粒转化实验提供合格材料。

    预计耗时：约 4 小时（含过夜培养）

  2. 2

    聚合酶链式反应（PCR）

    分子

    在体外特异性扩增目标 DNA 片段，获得大量拷贝。

    预计耗时：约 2 小时

  3. 3

    琼脂糖凝胶电泳

    分子

    按分子量大小分离核酸片段，用于检测 PCR 产物或提取的核酸质量。

    预计耗时：约 1.5 小时

  4. 4

    细胞传代培养

    细胞

    将培养的细胞按比例稀释后接种到新培养容器中，维持细胞对数生长期，避免接触抑制与营养耗尽，为后续实验提供状态良好的细胞。

    预计耗时：约 1 小时（不含培养观察）

  5. 5

    细胞冻存

    细胞

    将处于对数生长期的细胞经程序降温后保存于液氮中，长期维持细胞活力，便于后续复苏使用。

    预计耗时：约 1 小时（含程序降温）

  6. 6

    细胞复苏

    细胞

    将冻存的细胞快速解冻并接种培养，恢复细胞活力与增殖能力，用于后续实验。

    预计耗时：约 1 小时

  7. 7

    BCA 蛋白浓度测定

    蛋白

    用 BCA 比色法测定蛋白样品浓度，为后续电泳、免疫印迹等实验提供准确的蛋白上样量。

    预计耗时：约 1 小时

中等

  1. 8

    细胞脂质体转染

    综合

    用脂质体包裹质粒 DNA 导入真核细胞，使外源基因（如 Cas9/sgRNA）在细胞内表达，是分子到细胞的关键桥梁。

    预计耗时：约 2 天（含转染后培养）

  2. 9

    限制性内切酶酶切

    分子

    用限制性内切酶在特定识别位点切割 DNA，产生黏性末端或平末端，用于基因克隆与重组载体构建。

    预计耗时：约 3 小时（含电泳检测）

  3. 10

    质粒 DNA 提取（碱裂解法）

    分子

    从大肠杆菌中提取质粒 DNA，获得满足下游应用（酶切、测序、转染等）所需纯度和浓度的质粒。

    预计耗时：约 2–3 小时（不含过夜培养）

  4. 11

    CRISPR/Cas9 sgRNA 设计与载体构建

    综合

    设计靶向目的基因的 sgRNA 并将其克隆到 CRISPR/Cas9 表达载体中，为基因编辑提供载体工具。

    预计耗时：约 2–3 天（含连接转化与验证）

  5. 12

    DNA 凝胶回收与纯化

    分子

    从琼脂糖凝胶中回收并纯化目标 DNA 片段，去除杂质和凝胶，供后续酶切、连接等克隆操作。

    预计耗时：约 1.5 小时

  6. 13

    IPTG 诱导蛋白表达

    蛋白

    用 IPTG 诱导含重组表达载体的大肠杆菌表达目的蛋白，为后续纯化与功能研究提供蛋白来源。

    预计耗时：约 1 天（含过夜培养）

  7. 14

    MTT / CCK-8 细胞活力检测

    细胞

    用比色法检测细胞增殖与活力，用于药物毒性、细胞增殖等实验的定量分析。

    预计耗时：约 4–6 小时（MTT）或 2–3 小时（CCK-8）

  8. 15

    SDS-PAGE 蛋白电泳

    蛋白

    用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量分离蛋白质，用于蛋白纯度鉴定、表达检测与分子量估算。

    预计耗时：约 4 小时

进阶

  1. 16

    单克隆细胞株筛选与扩大培养

    综合

    从转染后的混合细胞群中筛选出稳定整合的单克隆细胞株，并扩大培养，获得遗传背景一致的细胞群体。

    预计耗时：约 2–4 周（含筛选与扩增）

  2. 17

    基因敲除/敲入效果鉴定

    综合

    提取单克隆细胞的基因组 DNA，通过 PCR 扩增靶点后用 T7E1 酶切或测序，验证基因敲除/敲入是否成功。

    预计耗时：约 2–3 天（含 PCR 与酶切/测序）

  3. 18

    流式细胞术检测

    细胞

    用流式细胞仪对单细胞悬液进行多参数分析，检测细胞周期、凋亡、表面标志物等，用于细胞功能研究。

    预计耗时：约 4–6 小时（含样品处理）

  4. 19

    Ni-NTA 亲和层析纯化蛋白

    蛋白

    利用 His 标签与 Ni-NTA 的特异性结合，从细胞裂解液中亲和纯化带组氨酸标签的重组蛋白，获得高纯度目的蛋白。

    预计耗时：约 1 天

  5. 20

    T4 DNA 连接与转化

    分子

    用 T4 DNA 连接酶将酶切后的载体与插入片段连接成重组质粒，再转化入感受态大肠杆菌，获得含目的重组子的克隆。

    预计耗时：约 2 天（含过夜培养）

  6. 21

    Western Blot（蛋白质免疫印迹）

    蛋白

    检测样品中特定蛋白质的表达情况。

    预计耗时：约 1 天

已做过计划做遇到困难未标记
flowchart TD pcr("聚合酶链式反应（PCR）") --> agarose_gel_electrophoresis("琼脂糖凝胶电泳") cell_passage("细胞传代培养") --> cell_cryopreservation("细胞冻存") cell_cryopreservation("细胞冻存") --> cell_recovery("细胞复苏") plasmid_extraction("质粒 DNA 提取（碱裂解法）") --> crispr_sgrna_design("CRISPR/Cas9 sgRNA 设计与载体构建") restriction_enzyme_digestion("限制性内切酶酶切") --> crispr_sgrna_design("CRISPR/Cas9 sgRNA 设计与载体构建") agarose_gel_electrophoresis("琼脂糖凝胶电泳") --> dna_gel_extraction("DNA 凝胶回收与纯化") cell_passage("细胞传代培养") --> flow_cytometry("流式细胞术检测") t4_dna_ligation_transformation("T4 DNA 连接与转化") --> iptg_induction("IPTG 诱导蛋白表达") single_cell_cloning("单克隆细胞株筛选与扩大培养") --> knockout_validation("基因敲除/敲入效果鉴定") pcr("聚合酶链式反应（PCR）") --> knockout_validation("基因敲除/敲入效果鉴定") crispr_sgrna_design("CRISPR/Cas9 sgRNA 设计与载体构建") --> lipofection("细胞脂质体转染") cell_passage("细胞传代培养") --> lipofection("细胞脂质体转染") cell_passage("细胞传代培养") --> mtt_cck8("MTT / CCK-8 细胞活力检测") iptg_induction("IPTG 诱导蛋白表达") --> ni_nta_affinity("Ni-NTA 亲和层析纯化蛋白") agarose_gel_electrophoresis("琼脂糖凝胶电泳") --> plasmid_extraction("质粒 DNA 提取（碱裂解法）") dna_gel_extraction("DNA 凝胶回收与纯化") --> restriction_enzyme_digestion("限制性内切酶酶切") plasmid_extraction("质粒 DNA 提取（碱裂解法）") --> restriction_enzyme_digestion("限制性内切酶酶切") iptg_induction("IPTG 诱导蛋白表达") --> sds_page("SDS-PAGE 蛋白电泳") lipofection("细胞脂质体转染") --> single_cell_cloning("单克隆细胞株筛选与扩大培养") competent_cell_preparation("大肠杆菌感受态制备") --> t4_dna_ligation_transformation("T4 DNA 连接与转化") restriction_enzyme_digestion("限制性内切酶酶切") --> t4_dna_ligation_transformation("T4 DNA 连接与转化") sds_page("SDS-PAGE 蛋白电泳") --> western_blot("Western Blot（蛋白质免疫印迹）") bca_assay("BCA 蛋白浓度测定")

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