分子入门
琼脂糖凝胶电泳
前置知识 / 技能
实验目的
按分子量大小分离核酸片段，用于检测 PCR 产物或提取的核酸质量。
实验原理
核酸在缓冲液中带负电荷，电场作用下向正极迁移；迁移速率与分子大小、胶浓度及电压有关，小片段迁移更快。
实验步骤
- 1配制琼脂糖凝胶
将琼脂糖溶于电泳缓冲液，加热溶解后冷却并加入核酸染料。
⚠ 胶浓度需根据目标片段大小选择。
- 2灌胶与凝固
将胶液倒入制胶槽，插入梳子，静置至完全凝固。
- 3上样
将样品与上样缓冲液混合后加入胶孔，并加入 DNA Marker。
- 4电泳
设定电压（如 100–120 V）进行电泳，直至指示剂迁移到合适位置。
- 5观察结果
在凝胶成像系统下观察条带并拍照记录。
所需试剂
- 琼脂糖
- TAE/TBE 电泳缓冲液
- 核酸染料
- 6× 上样缓冲液
- DNA Marker
所需仪器
- 电泳槽
- 电泳仪
- 凝胶成像系统
- 微波炉
- 微量移液器
安全提示
- ⚠ 核酸染料有潜在毒性，接触胶体时必须戴手套。
- ⚠ 电泳过程中不要触碰电泳槽和电极，防止触电。
- ⚠ 微波加热琼脂糖时防止过热喷溅烫伤。
预期结果
获得清晰分离的核酸条带，与 DNA Marker 比对可判断片段大小。
结果分析
✅ 正常结果
凝胶上出现清晰、锐利的条带，样品条带与 DNA Marker 比对后大小符合预期，无拖尾、无弥散。
解读：说明 DNA 完整性好、未降解，胶浓度与电压设置合适，分离效果理想。
⚠️ 异常结果
- 1条带弥散（smear）
原因：DNA 降解、上样量过多、电压过高产热，或胶浓度与片段大小不匹配。
- 2条带拖尾
原因：上样量过多、样品含盐量过高（如提取残留盐离子），或电泳缓冲液离子强度不合适。
- 3无条带或条带极弱
原因：DNA 上样量不足、DNA 已降解，或核酸染料失效、漏加。
- 4条带弯曲（微笑 / 皱眉形）
原因：凝胶不均匀或有气泡、上样孔破损、电压过高发热不均，或胶未完全凝固。
关联实验
实验前检查清单
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🧪 试剂
📦 耗材
🔬 仪器
🛡 安全提示
常见问题排查（Troubleshooting）
1无条带或条带极弱
可能原因
- DNA 上样量不足或已降解
- 核酸染料失效或漏加
- 电泳缓冲液错误（如误用水代替 TAE/TBE）
- 电压过高导致样品跑出胶
解决办法
- 增加上样量，重新检测 DNA 浓度
- 更换核酸染料，按说明书比例加入
- 使用正确的 TAE/TBE 缓冲液重新配胶和电泳
- 降低电压、缩短电泳时间
2条带模糊、拖尾（smear）
可能原因
- 上样量过大
- DNA 降解
- 电压过高，电泳过程中产热
- 琼脂糖胶浓度不合适
解决办法
- 减少上样量
- 使用新鲜提取的 DNA
- 降低电压，电泳时置于冰上或冷室
- 根据片段大小调整胶浓度（大片段用低浓度胶，小片段用高浓度胶）
3条带弯曲（微笑/皱眉形状）
可能原因
- 凝胶中存在气泡或杂质
- 上样孔不完整
- 电压过高导致发热不均
- 胶未完全凝固
解决办法
- 倒胶时避免气泡，完全凝固后再拔梳子
- 检查梳子，缓慢平稳地拔梳
- 降低电压
- 确保胶完全凝固（约 30 分钟）后再上样
4条带迁移异常（位置不对、大小与预期不符）
可能原因
- 胶浓度与目标片段大小不匹配
- 电压或电泳时间不当
- DNA Marker 未加载或已失效
解决办法
- 按目标片段大小选择合适的胶浓度
- 调整电压和电泳时间
- 加载合适的 DNA ladder，检查是否过期