分子入门
聚合酶链式反应（PCR）
前置知识 / 技能
无前置要求，可直接开始。
实验目的
在体外特异性扩增目标 DNA 片段，获得大量拷贝。
实验原理
以目标 DNA 为模板，利用耐热 DNA 聚合酶与上下游引物，通过「变性—退火—延伸」的循环，使目标片段呈指数级扩增。
实验步骤
- 1配制反应体系
在冰上按比例混合模板 DNA、引物、dNTP、DNA 聚合酶与缓冲液。
- 2设置 PCR 程序
设定变性（约 95℃）、退火（由引物 Tm 决定）、延伸（约 72℃）温度与循环数。
- 3运行扩增
启动 PCR 仪，完成 25–35 个循环。
- 4产物检测
取少量产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增结果。
所需试剂
- 模板 DNA
- 上游/下游引物
- dNTP（各 200 μM）
- Taq DNA 聚合酶
- PCR 缓冲液（含 Mg²⁺）
- 无菌去离子水
所需仪器
- PCR 仪
- 微量移液器
- PCR 管
- 冰盒
- 离心机
安全提示
- ⚠ 操作全程佩戴一次性手套，避免核酸污染。
- ⚠ 反应体系配制在冰上进行，防止酶失活。
- ⚠ 含核酸染料的检测步骤需在通风处操作并注意防护。
预期结果
电泳后在目标分子量位置出现单一、清晰的特异性条带。
结果分析
✅ 正常结果
琼脂糖凝胶电泳检测在目标分子量位置（如 500 bp）出现单一条带，清晰锐利，无非特异性条带或引物二聚体。
解读：说明引物特异性好、扩增成功、目标片段大小正确，产物可用于后续实验（如酶切、连接、测序）。
⚠️ 异常结果
- 1无扩增产物（电泳无条带）
原因：模板 DNA 降解或量不足、引物失效、退火温度过高，或反应体系漏加聚合酶 / dNTP 等关键组分。
- 2非特异性条带（出现多余条带）
原因：引物特异性差、退火温度过低，或 Mg²⁺ 浓度过高导致错配扩增。
- 3引物二聚体（约 50–100 bp 的弥散条带）
原因：引物浓度过高、模板量不足，或上下游引物 3' 端存在互补序列。
- 4条带拖尾 / 弥散（smear）
原因：模板量过多、循环数过多，或 DNA 聚合酶过量导致非特异扩增。
关联实验
实验前检查清单
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🧪 试剂
📦 耗材
🔬 仪器
🛡 安全提示
常见问题排查（Troubleshooting）
1无扩增产物（电泳无条带）
可能原因
- 模板 DNA 降解或量不足
- 引物设计不当或浓度过低
- 退火温度过高，引物无法结合
- DNA 聚合酶失活或漏加
- 反应体系中存在抑制剂（如 EDTA、SDS 残留）
解决办法
- 用分光光度计或电泳检测模板 DNA 质量与浓度
- 重新设计引物，或做引物浓度梯度
- 降低退火温度，或做梯度 PCR 优化
- 更换新批次的 DNA 聚合酶，核对反应体系
- 重新纯化模板 DNA
2出现非特异性条带
可能原因
- 退火温度过低，引物发生非特异性结合
- 引物特异性差或浓度过高
- 镁离子（Mg²⁺）浓度过高
- 循环数过多
解决办法
- 提高退火温度
- 优化引物设计、降低引物浓度
- 降低 Mg²⁺ 浓度，做梯度优化
- 减少循环数至 25–30
3出现引物二聚体
可能原因
- 引物浓度过高
- 上下游引物 3' 端存在互补
- 模板量过低
解决办法
- 降低引物浓度
- 重新设计引物，避免 3' 端互补
- 增加模板量
4条带拖尾（smear）
可能原因
- DNA 聚合酶过量
- 镁离子（Mg²⁺）浓度过高
- 退火温度过低
- 循环数过多
解决办法
- 降低酶用量
- 降低 Mg²⁺ 浓度
- 提高退火温度
- 减少循环数