细胞入门
细胞冻存
前置知识 / 技能
实验目的
将处于对数生长期的细胞经程序降温后保存于液氮中，长期维持细胞活力，便于后续复苏使用。
实验原理
在冷冻保护剂（如 DMSO）存在下缓慢降温，减少细胞内冰晶形成对细胞的损伤；细胞先经 -80℃ 缓慢降温，再转入液氮长期保存，可显著提高复苏存活率。
实验步骤
- 1准备
预热培养基、PBS 和胰酶，配制含 10% DMSO 的冻存液。
- 2消化
取对数生长期细胞，胰酶消化、离心收集。
- 3重悬
用冻存液重悬细胞，调整密度约 1×10⁶–1×10⁷ 个/mL。
- 4分装
分装至冻存管，标记名称与日期。
- 5程序降温
4℃ 30 min → -20℃ 1–2 h → -80℃ 过夜（或用程序降温盒）。
- 6液氮保存
转入液氮罐长期保存。
所需试剂
- DMEM 培养基
- 胎牛血清（FBS）
- DMSO（10%）
- 胰蛋白酶-EDTA
- PBS 缓冲液
所需仪器
- 超净工作台
- 台式离心机
- 倒置显微镜
- 程序降温盒
- 液氮罐
- -80℃ 冰箱
安全提示
- ⚠ DMSO 有刺激性，戴手套并避光操作。
- ⚠ 液氮操作戴防冻手套，防止冻伤。
- ⚠ 冻存管需旋紧，防止液氮渗入。
预期结果
复苏后细胞存活率高（>80%），形态正常，能正常贴壁增殖。
结果分析
✅ 正常结果
复苏后细胞存活率 >80%，贴壁良好、形态正常、增殖正常，无污染。
解读：说明冻存时细胞状态好、降温程序合理、DMSO 浓度合适，冻存方法可靠。
⚠️ 异常结果
- 1复苏后存活率低
原因：冻存时细胞状态差、降温过快、DMSO 浓度不当、冻存液配制错误。
- 2细胞复苏后不增殖
原因：冻存时细胞密度过低、冻存管密封不良、液氮罐温度异常。
- 3复苏后污染
原因：冻存前已污染、冻存管密封不严、操作污染。
关联实验
实验前检查清单
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🧪 试剂
📦 耗材
🔬 仪器
🛡 安全提示
常见问题排查（Troubleshooting）
1复苏后存活率低
可能原因
- 冻存时细胞状态差
- 降温过快
- DMSO 浓度不当
解决办法
- 选用对数期细胞
- 用程序降温盒
- 核对冻存液 DMSO 浓度
2复苏后不增殖
可能原因
- 冻存密度过低
- 冻存管密封不良
- 液氮罐温度异常
解决办法
- 提高冻存密度
- 检查管盖密封
- 检查液氮罐液面
3复苏后污染
可能原因
- 冻存前已污染
- 冻存管密封不严
- 操作污染
解决办法
- 冻存前确认无污染
- 更换冻存管
- 规范无菌操作