大肠杆菌感受态制备

实验目的

制备能高效摄取外源 DNA 的大肠杆菌感受态细胞，为质粒转化实验提供合格材料。

实验原理

用低温 CaCl₂ 处理处于对数生长期的大肠杆菌，改变细胞膜通透性，使细胞进入易摄取外源 DNA 的「感受态」；热激时外源质粒经细胞膜进入胞内。

实验步骤

1. 1活化菌种

   挑取单菌落接种 LB 培养基，37℃ 摇床过夜培养。

2. 2转接培养

   按 1:100 转接至新鲜 LB，37℃ 振荡培养至 OD600≈0.4–0.6。

3. 3冰浴预冷

   菌液冰浴 10–30 min，4℃ 低速离心收集菌体。

4. 4CaCl₂ 处理

   用预冷 0.1 M CaCl₂ 轻柔重悬菌体，冰浴 30 min。

5. 5再次离心

   4℃ 低速离心，弃上清。

6. 6甘油重悬分装

   用含 10–15% 甘油的预冷 CaCl₂ 重悬，分装至预冷冻存管。

7. 7速冻保存

   -80℃ 保存（或液氮速冻后再转 -80℃）。

所需试剂

• LB 培养基
• 0.1 M CaCl₂（预冷）
• 甘油（10–15%）
• 氨苄青霉素（100 μg/mL（如需筛选））

所需仪器

• 恒温摇床
• 低温离心机
• 超净工作台
• 分光光度计
• 微量移液器
• -80℃ 冰箱

安全提示

• ⚠ 全程低温操作，冰浴充分，保证菌体处于对数生长期。
• ⚠ 无菌操作，防止杂菌污染。
• ⚠ 重悬动作轻柔，避免机械剪切损伤菌体。
• ⚠ 废弃菌液需高压灭菌后处理。

预期结果

制备的感受态细胞转化效率达 10⁵–10⁷ CFU/μg 质粒 DNA，无杂菌污染。

关联实验

• T4 DNA 连接与转化