T4 DNA 连接与转化

实验目的

用 T4 DNA 连接酶将酶切后的载体与插入片段连接成重组质粒，再转化入感受态大肠杆菌，获得含目的重组子的克隆。

实验原理

T4 DNA 连接酶催化 DNA 双链中相邻的 3'-OH 与 5'-磷酸基团形成磷酸二酯键，将具有互补黏性末端的载体与插入片段共价连接；重组质粒经热激转化进入感受态细胞，在含抗生素平板上筛选出阳性克隆。

实验步骤

1. 1配制连接体系

   按载体:插入片段约 1:3 摩尔比，加入 T4 连接酶与缓冲液，16℃ 连接过夜或室温连接 1 小时。

2. 2感受态解冻

   将感受态细胞从 -80℃ 取出，冰上缓慢解冻。

3. 3加入 DNA

   将连接产物加入感受态细胞，轻轻混匀，冰浴 30 min。

4. 4热激

   42℃ 水浴热激 45–90 s，迅速转冰浴 2 min。

5. 5复苏

   加入无抗 LB 培养基，37℃ 摇床复苏 45–60 min。

6. 6涂板

   取适量菌液涂布含相应抗生素的 LB 平板。

7. 7培养

   37℃ 倒置培养过夜（12–16 h），观察菌落。

8. 8挑取鉴定

   挑取单菌落，进行菌落 PCR 或酶切鉴定阳性克隆。

所需试剂

• 酶切后的载体与插入片段
• T4 DNA 连接酶
• 连接缓冲液（10×（含 ATP））
• 感受态大肠杆菌
• LB 培养基（含/不含抗生素）
• 含抗生素 LB 平板

所需仪器

• 恒温水浴锅
• 恒温摇床
• 超净工作台
• 微量移液器
• 涂布棒
• 培养箱

安全提示

• ⚠ 热激时间需精确控制，过长会杀死细胞、过短则转化效率低。
• ⚠ 无菌操作，涂布棒需冷却后再使用。
• ⚠ 含抗生素平板与菌液按规范处理。

预期结果

平板上长出单个分散的白色菌落，菌落 PCR/酶切鉴定为含正确重组质粒的阳性克隆。

关联实验

• 大肠杆菌感受态制备
• 限制性内切酶酶切
• IPTG 诱导蛋白表达