分子中等
DNA 凝胶回收与纯化
前置知识 / 技能
实验目的
从琼脂糖凝胶中回收并纯化目标 DNA 片段，去除杂质和凝胶，供后续酶切、连接等克隆操作。
实验原理
在紫外/蓝光下切取含目标条带的凝胶块，用高盐缓冲液溶解凝胶，DNA 在高盐条件下吸附到硅胶膜柱上，经洗涤去杂质后，用低盐缓冲液洗脱得到纯化 DNA。
实验步骤
- 1切胶
在紫外/蓝光切胶仪上，用干净刀片切下目标条带，尽量切除多余凝胶。
- 2称量
称量胶块重量，按比例加入溶胶缓冲液。
- 3溶胶
50–60℃ 水浴孵育，间或颠倒混匀，直至凝胶完全溶解。
- 4上柱结合
将溶胶液加入吸附柱，静置后离心，DNA 结合到柱膜上。
- 5洗涤
加入洗涤缓冲液离心洗涤 1–2 次，去除盐分与杂质。
- 6晾干
空转离心去除残留乙醇。
- 7洗脱
加入预热洗脱缓冲液或无菌水，静置后离心收集 DNA。
- 8检测
取少量产物电泳或用 NanoDrop 测定浓度与纯度。
所需试剂
- 琼脂糖凝胶（含目标 DNA 条带）
- 溶胶缓冲液（高盐）
- 洗涤缓冲液（含乙醇）
- 洗脱缓冲液（TE 或无菌水）
所需仪器
- 蓝光/紫外切胶仪
- 恒温水浴锅
- 台式离心机
- NanoDrop 分光光度计
- 微量移液器
安全提示
- ⚠ 紫外切胶时佩戴护目镜，尽量减少曝光时间。
- ⚠ 溶胶温度不宜过高，避免 DNA 损伤。
- ⚠ 含核酸染料的凝胶和缓冲液按规范处理。
预期结果
回收得到浓度与纯度合格的目标 DNA 片段，电泳验证为单一条带。
结果分析
✅ 正常结果
回收产物电泳显示目标位置单一条带，无非特异条带；A260/A280 约 1.8，浓度满足后续酶切/连接需求。
解读：说明切胶准确、溶胶与洗脱充分，DNA 片段完整且纯度高，可用于下游克隆实验。
⚠️ 异常结果
- 1回收产物浓度低
原因：目标条带量少、溶胶不充分、洗脱体积过大或洗脱次数不足。
- 2产物中混有杂带
原因：切胶不准确带入邻近条带、结合不充分。
- 3A260/A280 异常
原因：洗涤不充分残留盐分、柱膜残留乙醇，或存在蛋白污染。
- 4DNA 降解或断裂
原因：紫外照射过久、溶胶温度过高或时间过长。
关联实验
实验前检查清单
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🧪 试剂
📦 耗材
🔬 仪器
🛡 安全提示
常见问题排查（Troubleshooting）
1回收浓度低
可能原因
- 目标条带量少
- 溶胶不充分
- 洗脱体积过大
- DNA 未充分结合
解决办法
- 增大上样量
- 延长溶胶时间
- 减小洗脱体积
- 延长结合静置时间
2回收片段有杂带
可能原因
- 切胶不准确
- 邻近条带混入
解决办法
- 精细切胶
- 重新电泳分离后再切
3回收 DNA 无法用于下游
可能原因
- 洗涤不彻底残留盐分/乙醇
- 紫外损伤
解决办法
- 增加洗涤次数
- 减少紫外曝光时间，改用蓝光切胶