综合中等
CRISPR/Cas9 sgRNA 设计与载体构建
前置知识 / 技能
实验目的
设计靶向目的基因的 sgRNA 并将其克隆到 CRISPR/Cas9 表达载体中，为基因编辑提供载体工具。
实验原理
根据目标基因序列，利用 PAM（NGG）设计 20 bp 的 sgRNA 靶点序列；合成的 sgRNA 寡核苷酸经退火形成双链，通过酶切-连接克隆到含 Cas9 与 sgRNA 骨架的表达载体中，经转化、挑克隆、测序验证得到正确载体。
实验步骤
- 1靶点设计
在目标基因外显子区寻找 PAM（NGG）位点，设计 20 bp sgRNA 序列。
- 2引物退火
合成正反义寡核苷酸，加接头后 95℃ 退火形成双链。
- 3载体酶切
用限制性内切酶（如 BbsI）线性化 sgRNA 表达载体。
- 4连接
T4 DNA 连接酶将退火产物连接到线性化载体。
- 5转化
连接产物转化感受态大肠杆菌。
- 6挑克隆验证
挑取单菌落，菌落 PCR 或测序验证插入序列正确。
所需试剂
- sgRNA 寡核苷酸（正/反义）
- sgRNA 表达载体（含 Cas9）
- 限制性内切酶（如 BbsI）
- T4 DNA 连接酶
- 感受态大肠杆菌
- LB 培养基 / 平板
所需仪器
- 恒温水浴锅
- PCR 仪
- 超净工作台
- 恒温摇床
- 微量移液器
安全提示
- ⚠ 基因编辑相关操作需遵守实验室生物安全规范。
- ⚠ sgRNA 靶点需经脱靶分析，避免非特异编辑。
- ⚠ 测序验证插入序列，确保无突变。
预期结果
测序确认 sgRNA 序列正确插入载体，无移码或突变，可用于转染实验。
结果分析
✅ 正常结果
测序显示 sgRNA 序列与设计完全一致、方向正确、无突变，载体构建成功。
解读：说明退火、酶切、连接、转化各步骤均成功，sgRNA 载体可用于下游转染与基因编辑。
⚠️ 异常结果
- 1无克隆或克隆很少
原因：连接失败、酶切不完全、感受态失效。
- 2测序序列错误
原因：引物退火失败、序列设计错误、挑到错误克隆。
- 3载体自连背景高
原因：酶切不完全、载体未去磷酸化。
关联实验
实验前检查清单
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🧪 试剂
📦 耗材
🔬 仪器
🛡 安全提示
常见问题排查（Troubleshooting）
1无克隆或克隆很少
可能原因
- 连接失败
- 酶切不完全
- 感受态失效
解决办法
- 检查连接体系与比例
- 重新酶切并验证
- 重新制备感受态
2测序序列错误
可能原因
- 退火失败
- 序列设计错误
- 挑错克隆
解决办法
- 重新退火
- 核对 sgRNA 序列
- 多挑几个克隆送测
3载体自连背景高
可能原因
- 酶切不完全
- 载体未去磷酸化
解决办法
- 提高酶切效率
- 载体去磷酸化处理