质粒 DNA 提取（碱裂解法）
前置知识 / 技能
实验目的
从大肠杆菌中提取质粒 DNA，获得满足下游应用（酶切、测序、转染等）所需纯度和浓度的质粒。
实验原理
在碱性条件（NaOH/SDS）下细胞裂解，基因组 DNA 与质粒 DNA 均发生变性；加入酸性醋酸钾中和后，超螺旋质粒 DNA 能快速复性并保持溶解，而基因组 DNA 与蛋白质因分子量大、结构复杂而变性沉淀，随细胞碎片被离心去除，上清中富集质粒 DNA，再经乙醇沉淀或吸附柱纯化得到产物。
实验步骤
- 1培养
挑取含目的质粒的单菌落，接种到含抗生素的 LB 培养基，37℃ 摇床过夜培养。
- 2收集菌体
分次离心收集菌液（如 12000 rpm，1 min），弃上清。
- 3重悬
加入溶液 I（含 RNase A）充分重悬菌体。
- 4裂解
加入溶液 II（NaOH/SDS），轻柔颠倒混匀，静置至液体变澄清黏稠。
⚠ 裂解时间不宜过长，避免质粒被破坏。
- 5中和
加入预冷溶液 III，轻柔颠倒混匀，冰上静置至出现白色絮状沉淀。
- 6离心
高速离心（如 12000 rpm，10 min），取上清。
- 7纯化
上清经吸附柱结合、洗涤，或经异丙醇/乙醇沉淀。
- 8洗脱
用 TE 缓冲液或洗脱缓冲液洗脱质粒 DNA。
- 9检测
用 NanoDrop 测定浓度与纯度（A260/A280）。
所需试剂
- LB 培养基（含氨苄青霉素）
- 溶液 I（重悬液，含 RNase A）
- 溶液 II（NaOH/SDS 裂解液）
- 溶液 III（醋酸钾中和液）
- 异丙醇 / 无水乙醇
- TE 缓冲液 / 洗脱缓冲液
所需仪器
- 恒温摇床
- 台式离心机
- 微量移液器
- NanoDrop 分光光度计
- 涡旋振荡器
安全提示
- ⚠ 含抗生素的培养基和菌液需高压灭菌后处理。
- ⚠ 溶液 II 含强碱，避免接触皮肤和眼睛。
- ⚠ 若使用苯酚/氯仿抽提，必须在通风橱中操作并做好防护。
- ⚠ 操作轻柔，避免基因组 DNA 断裂污染质粒。
预期结果
得到无色透明的质粒 DNA 溶液，A260/A280 约 1.8，浓度满足下游实验要求；电泳可见清晰的超螺旋条带。
结果分析
✅ 正常结果
得到无色透明的质粒 DNA 溶液，A260/A280 在 1.8–2.0 之间；琼脂糖凝胶电泳可见以超螺旋构象为主（可能含少量开环/线性），无基因组 DNA 和 RNA 污染。
解读：说明菌体裂解充分、质粒完整、RNA 和蛋白质去除干净，纯度和浓度满足酶切、测序、转染等下游应用。
⚠️ 异常结果
- 1质粒产量低（浓度低）
原因：菌体量不足、质粒拷贝数低、裂解不充分、洗脱不完全或洗脱液 pH 不当。
- 2基因组 DNA 污染（电泳上方出现大分子量条带）
原因：裂解时间过长、颠倒混匀过于剧烈导致基因组 DNA 断裂混入。
- 3RNA 污染（电泳下方出现弥散条带）
原因：RNase A 失效或用量不足、溶液 I 未充分混匀。
- 4蛋白污染（A260/A280 明显低于 1.8）
原因：中和后离心不彻底、沉淀或吸附柱洗涤不充分、苯酚残留。
- 5缺少超螺旋条带（大量开环/线性）
原因：操作中涡旋过于剧烈或反复冻融导致机械剪切、试剂 pH 不当或过期。
关联实验
实验前检查清单
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