细胞进阶
流式细胞术检测
前置知识 / 技能
实验目的
用流式细胞仪对单细胞悬液进行多参数分析，检测细胞周期、凋亡、表面标志物等，用于细胞功能研究。
实验原理
细胞经荧光染料或抗体标记后制成单细胞悬液，流式细胞仪使细胞逐一通过激光检测区，通过测量散射光与荧光信号，对细胞大小、颗粒度及目标分子表达进行定量分析。
实验步骤
- 1制备单细胞悬液
消化或机械分散细胞，过滤去除团块，计数。
- 2标记
按实验目的进行荧光抗体或染料标记（如 PI、Annexin V-FITC）。
- 3洗涤
PBS 洗涤去除未结合抗体，重悬于缓冲液。
- 4设置对照
制备阴性对照、单染对照用于调补偿与设门。
- 5上机检测
校准流式细胞仪，上样采集数据。
- 6数据分析
用软件设门分析，统计目标细胞比例。
所需试剂
- 细胞悬液
- 荧光标记抗体/染料（如 PI、Annexin V-FITC）
- PBS 缓冲液
- 固定剂（如需）
所需仪器
- 流式细胞仪
- 台式离心机
- 微量移液器
- 细胞筛网
- 倒置显微镜
安全提示
- ⚠ 荧光染料多具毒性或光敏性，避光并戴手套。
- ⚠ 需设置补偿对照，避免荧光串色误判。
- ⚠ 样品需为单细胞悬液，避免堵塞流路。
预期结果
单细胞悬液合格，各荧光通道信号清晰，设门合理，目标细胞比例可重复、符合预期。
结果分析
✅ 正常结果
单细胞悬液无团块、各通道信号清晰、设门合理，目标细胞比例重复性好、符合预期。
解读：说明样品制备、标记与补偿设置正确，流式数据可靠，可准确反映细胞周期、凋亡或标志物表达。
⚠️ 异常结果
- 1细胞团块多堵塞流路
原因：消化不充分、未过筛、细胞死亡聚集。
- 2荧光信号弱或阴性
原因：抗体/染料失效、标记条件不当、细胞未表达目标分子。
- 3补偿不正确（荧光串色）
原因：未设单染对照、补偿矩阵错误。
- 4结果重复性差
原因：仪器未校准、样品处理不一致、设门标准不统一。
关联实验
实验前检查清单
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🧪 试剂
📦 耗材
🔬 仪器
🛡 安全提示
常见问题排查（Troubleshooting）
1细胞团块堵塞流路
可能原因
- 消化不充分
- 未过筛
- 细胞死亡聚集
解决办法
- 充分消化
- 过筛过滤
- 去除死细胞
2荧光信号弱或阴性
可能原因
- 抗体/染料失效
- 标记条件不当
- 细胞未表达目标分子
解决办法
- 更换新抗体
- 优化标记浓度与时间
- 设阳性对照
3补偿不正确（荧光串色）
可能原因
- 未设单染对照
- 补偿矩阵错误
解决办法
- 制备单染对照管
- 重新计算补偿矩阵