蛋白进阶
Ni-NTA 亲和层析纯化蛋白
前置知识 / 技能
实验目的
利用 His 标签与 Ni-NTA 的特异性结合，从细胞裂解液中亲和纯化带组氨酸标签的重组蛋白，获得高纯度目的蛋白。
实验原理
重组蛋白 N 端或 C 端融合 6×His 标签，组氨酸残基可与 Ni²⁺-NTA 螯合柱特异结合；用含低浓度咪唑的缓冲液洗去杂蛋白后，再用高浓度咪唑竞争洗脱目的蛋白。
实验步骤
- 1裂解
重悬诱导后的菌体，超声或裂解液裂解细胞。
- 2澄清
高速离心，取可溶上清。
- 3平衡
用结合缓冲液（含低浓度咪唑）平衡 Ni-NTA 柱。
- 4上样
上清上柱，His 标签蛋白与 Ni²⁺ 结合。
- 5洗涤
用含 20–50 mM 咪唑缓冲液洗去非特异结合杂蛋白。
- 6洗脱
用含 250–500 mM 咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。
- 7检测
SDS-PAGE 检测各组分纯度，测定蛋白浓度。
所需试剂
- 结合缓冲液（含低浓度咪唑）
- 洗脱缓冲液（高浓度咪唑）
- Ni-NTA 填料
- 裂解缓冲液
- 蛋白酶抑制剂
所需仪器
- 层析柱
- 超声破碎仪
- 高速离心机
- 微量移液器
- SDS-PAGE 装置
- NanoDrop 分光光度计
安全提示
- ⚠ 超声破碎时注意噪音防护与样品降温。
- ⚠ 咪唑缓冲液有刺激性，戴手套操作。
- ⚠ 蛋白样品低温操作，防止降解。
预期结果
洗脱组分中目的蛋白纯度 >90%，SDS-PAGE 显示单一条带，产量满足后续实验。
结果分析
✅ 正常结果
洗脱组分 SDS-PAGE 显示目的蛋白单一条带，纯度 >90%，杂蛋白少；蛋白浓度与产量满足后续实验需求。
解读：说明 His 标签结合正常、洗涤与洗脱条件合适，获得高纯度重组蛋白，可用于功能研究或结构解析。
⚠️ 异常结果
- 1目的蛋白不结合柱（穿透液中有目的蛋白）
原因：His 标签未暴露或降解、柱上 Ni²⁺ 脱落、结合缓冲液咪唑浓度过高。
- 2洗脱蛋白纯度低（含杂蛋白）
原因：洗涤不充分、咪唑浓度梯度不合理。
- 3目的蛋白沉淀
原因：缓冲液 pH 或盐浓度不当、蛋白不稳定。
- 4洗脱无蛋白
原因：表达量低、His 标签未表达、柱未平衡。
关联实验
实验前检查清单
勾选已准备好的项目，进度保存在本机浏览器，刷新页面不丢失。
🧪 试剂
📦 耗材
🔬 仪器
🛡 安全提示
常见问题排查（Troubleshooting）
1目的蛋白不结合柱
可能原因
- His 标签未暴露或降解
- 柱上 Ni²⁺ 脱落
- 结合缓冲液咪唑浓度过高
解决办法
- 改用变性条件纯化或换标签
- 重新挂镍再生柱
- 降低结合液咪唑浓度
2洗脱蛋白纯度低
可能原因
- 洗涤不充分
- 咪唑浓度梯度不合理
解决办法
- 增加洗涤体积
- 用梯度咪唑洗脱分离杂蛋白
3洗脱无蛋白
可能原因
- 表达量低
- His 标签未表达
- 柱未平衡
解决办法
- 优化诱导条件
- 验证表达载体
- 重新平衡柱子