蛋白中等
SDS-PAGE 蛋白电泳
前置知识 / 技能
实验目的
用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量分离蛋白质，用于蛋白纯度鉴定、表达检测与分子量估算。
实验原理
SDS 使蛋白变性并带上均匀负电荷，消除原有电荷差异；蛋白在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大小分离，经染色后显示条带。
实验步骤
- 1制胶
配制分离胶与浓缩胶，灌入玻璃板并插梳子待凝固。
- 2样品处理
蛋白样品加 loading buffer，95–100℃ 变性 5 min。
- 3上样
组装电泳槽，加入电泳缓冲液，上样并加蛋白 Marker。
- 4电泳
先低压（80 V）跑浓缩胶，再高压（120 V）跑分离胶。
- 5染色
取下凝胶，用考马斯亮蓝染色。
- 6脱色
脱色液脱色至条带清晰，拍照分析。
所需试剂
- 30% 丙烯酰胺
- SDS
- TEMED
- 过硫酸铵（APS）
- 电泳缓冲液（Tris-甘氨酸）
- 考马斯亮蓝染液
- 蛋白 Marker
- loading buffer
所需仪器
- 垂直电泳槽
- 电泳仪
- 微量移液器
- 脱色摇床
- 凝胶成像系统
安全提示
- ⚠ 丙烯酰胺未聚合时有神经毒性，戴手套操作。
- ⚠ TEMED 有刺激性气味，通风处使用。
- ⚠ 电泳时注意高压安全，勿触碰电极。
预期结果
蛋白条带清晰、分离良好，Marker 分子量梯度正常，目的蛋白在预期位置。
结果分析
✅ 正常结果
条带清晰锐利、无拖尾，Marker 各分子量条带分离正常，目的蛋白条带位置符合预期分子量。
解读：说明凝胶制备良好、电泳条件合适、样品处理正确，可用于纯度判断与分子量估算。
⚠️ 异常结果
- 1条带模糊拖尾
原因：蛋白上样量过多、电压过高、凝胶聚合不均。
- 2无条带或极弱
原因：上样量不足、蛋白降解、染色液失效。
- 3条带弯曲（微笑/皱眉形）
原因：凝胶聚合不均、边缘效应、上样量不均。
- 4蛋白条带出现竖纹
原因：样品含盐或核酸、未充分变性。
关联实验
实验前检查清单
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🧪 试剂
📦 耗材
🔬 仪器
🛡 安全提示
常见问题排查（Troubleshooting）
1条带模糊拖尾
可能原因
- 上样量过多
- 电压过高
- 凝胶聚合不均
解决办法
- 减少上样量
- 降低电泳电压
- 重新配制凝胶
2无条带或极弱
可能原因
- 上样量不足
- 蛋白降解
- 染色液失效
解决办法
- 增加上样量
- 加蛋白酶抑制剂
- 更换染色液
3条带弯曲（微笑形）
可能原因
- 凝胶聚合不均
- 边缘效应
- 上样量不均
解决办法
- 充分混匀制胶
- 减少边缘孔上样
- 保证各孔上样一致