蛋白进阶
Western Blot（蛋白质免疫印迹）
前置知识 / 技能
实验目的
检测样品中特定蛋白质的表达情况。
实验原理
蛋白质经 SDS-PAGE 按分子量分离后，通过电转移印到固相膜上，再用特异性一抗结合目标蛋白、酶标二抗放大信号，最终经底物显色/发光检测。
实验步骤
- 1蛋白提取与定量
裂解细胞/组织提取总蛋白，并用 BCA 等方法测定浓度。
- 2SDS-PAGE 电泳
蛋白样品变性后上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
- 3转膜
将凝胶中的蛋白电转移到 PVDF 或 NC 膜上。
- 4封闭
用封闭液孵育膜，减少非特异性结合。
- 5抗体孵育
依次孵育一抗与二抗，充分洗涤去除未结合抗体。
- 6显色检测
加入底物进行化学发光或显色，采集图像。
所需试剂
- 蛋白样品
- 一抗
- 二抗
- 封闭液
- TBST 洗膜缓冲液
- 转膜缓冲液
- 化学发光底物
所需仪器
- 垂直电泳槽
- 转膜仪
- 摇床
- 凝胶成像系统
- 低温离心机
安全提示
- ⚠ 化学发光底物需避光保存与操作。
- ⚠ 甲醇等有机试剂应在通风橱中操作。
- ⚠ 一抗、二抗需低温保存，避免反复冻融。
预期结果
在目标蛋白对应分子量处出现清晰、特异性的条带。
结果分析
✅ 正常结果
目标蛋白对应分子量处出现清晰、特异的单一条带，无非特异性条带；内参蛋白（如 β-actin）在各泳道条带粗细均匀一致。
解读：说明抗体特异性好、一抗/二抗浓度合适、封闭与洗涤充分，目标蛋白被成功检测，可进行条带灰度定量分析。
⚠️ 异常结果
- 1无条带（目标蛋白位置无信号）
原因：蛋白上样量不足或已降解、抗体失效或稀释过度、转膜不充分导致蛋白未转上膜。
- 2背景过高（整条膜发黑）
原因：封闭不充分、一抗或二抗浓度过高、洗涤不充分、曝光时间过长。
- 3非特异性条带（出现多余条带）
原因：抗体特异性差、封闭不足、二抗与非目标蛋白发生交叉反应。
- 4条带弥散、模糊
原因：蛋白降解、电泳条件不当（电压过高或凝胶不均）、抗体浓度过高或孵育时间过长。
- 5内参条带粗细不均
原因：各泳道上样量不一致、蛋白定量不准、加样误差。
关联实验
实验前检查清单
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