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综合进阶

基因敲除/敲入效果鉴定

预计耗时：约 2–3 天（含 PCR 与酶切/测序）

📌 学习状态

前置知识 / 技能

实验目的

提取单克隆细胞的基因组 DNA，通过 PCR 扩增靶点后用 T7E1 酶切或测序，验证基因敲除/敲入是否成功。

实验原理

CRISPR/Cas9 切割目标位点后，细胞经非同源末端连接（NHEJ）修复会产生插入/缺失突变（indel）；提取基因组 DNA 后 PCR 扩增靶点，T7E1 内切酶能识别并切割错配形成的异源双链，或直接测序确认 indel。

实验步骤

  1. 1提取基因组

    裂解单克隆细胞，提取基因组 DNA。

  2. 2PCR 扩增

    设计跨越靶点的引物，PCR 扩增靶点区域。

  3. 3变性退火

    PCR 产物变性后缓慢退火，形成异源双链。

  4. 4T7E1 酶切

    加入 T7E1 内切酶消化错配位点。

  5. 5电泳检测

    琼脂糖电泳检测酶切片段。

  6. 6测序确认

    阳性克隆 PCR 产物送测序，确认 indel 序列。

所需试剂

  • 基因组 DNA（单克隆细胞）
  • 靶点 PCR 引物
  • dNTP
  • DNA 聚合酶
  • T7E1 内切酶
  • 琼脂糖与核酸染料

所需仪器

  • PCR 仪
  • 恒温水浴锅
  • 电泳仪
  • 凝胶成像系统
  • NanoDrop 分光光度计
  • 微量移液器

安全提示

  • ⚠ T7E1 酶低温保存，快速操作。
  • ⚠ 核酸染料操作注意防护。
  • ⚠ 设野生型对照，区分背景切割。

预期结果

T7E1 酶切电泳显示目标条带被切成两个片段，测序确认靶点处存在 indel 突变，证明敲除成功。

结果分析

✅ 正常结果

T7E1 酶切后电泳出现预期的两个切割片段，测序显示靶点有 indel，与野生型明显不同。

解读：说明 CRISPR/Cas9 成功在靶点引入 indel，基因敲除/敲入已发生，单克隆鉴定完成。

⚠️ 异常结果

  • 1无酶切片段（T7E1 阴性）

    原因：敲除未发生、PCR 扩增失败、退火条件不当。

  • 2电泳背景高、条带不清晰

    原因：基因组 DNA 质量差、PCR 非特异扩增。

  • 3测序无突变

    原因：挑到的克隆未发生编辑、靶点设计错误。

  • 4PCR 无产物

    原因：引物设计错误、基因组 DNA 降解、扩增条件不当。

关联实验

实验前检查清单

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🧪 试剂

📦 耗材

🔬 仪器

🛡 安全提示

常见问题排查（Troubleshooting）

1T7E1 阴性（无酶切片段）

可能原因

  • 敲除未发生
  • PCR 扩增失败
  • 退火条件不当

解决办法

  • 重新挑克隆
  • 优化 PCR 条件
  • 优化变性退火程序
2测序无突变

可能原因

  • 克隆未发生编辑
  • 靶点设计错误

解决办法

  • 多挑几个克隆
  • 重新设计 sgRNA 靶点
3PCR 无产物

可能原因

  • 引物设计错误
  • 基因组 DNA 降解
  • 扩增条件不当

解决办法

  • 重新设计引物
  • 重新提取基因组
  • 优化退火温度