单克隆细胞株筛选与扩大培养

实验目的

从转染后的混合细胞群中筛选出稳定整合的单克隆细胞株，并扩大培养，获得遗传背景一致的细胞群体。

实验原理

转染载体携带抗性基因（如嘌呤霉素抗性），用相应药物筛选杀死未整合的细胞；再用有限稀释法将存活细胞稀释到单细胞/孔，挑取由单个细胞增殖形成的单克隆，逐级扩大培养。

实验步骤

1. 1确定药物浓度

   用未转染细胞做杀伤曲线，确定最小致死浓度。

2. 2药物筛选

   转染 48 h 后加入筛选药物（如嘌呤霉素），持续培养至未转染细胞死亡。

3. 3有限稀释

   将抗性细胞消化计数，梯度稀释至 0.5–1 细胞/孔接种 96 孔板。

4. 4挑单克隆

   标记由单个细胞增殖形成的单克隆孔。

5. 5扩大培养

   单克隆依次传代至 24 孔、6 孔、培养瓶。

6. 6鉴定与冻存

   提取基因组或蛋白，鉴定敲除/敲入效果并冻存。

所需试剂

• 筛选药物（如嘌呤霉素）
• DMEM 培养基
• 胎牛血清（FBS）
• 胰蛋白酶-EDTA
• PBS 缓冲液

所需仪器

• 超净工作台
• CO₂ 培养箱
• 倒置显微镜
• 96 孔板
• 微量移液器

安全提示

• ⚠ 筛选药物有毒性，戴手套操作，妥善处理废液。
• ⚠ 有限稀释需确保单细胞接种，避免混克隆。
• ⚠ 全程无菌操作，防止污染。

预期结果

获得若干由单个细胞增殖而来的单克隆细胞株，扩增后冻存，待鉴定确认敲除/敲入成功。

关联实验

• 细胞脂质体转染
• 基因敲除/敲入效果鉴定
• 细胞传代培养